本发明涉及一种甘蔗梢腐病病原菌(Fusarium?moniliforme)小种gx1的分子检测方法,包括引物和探针设计、提取甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的DNA、建立qPCR检测的反应体系、qPCR检测的反应程序和qPCR检测结果。本发明采用Taqman探针的实时定量PCR检测方法,具有灵敏度高,特异性好,所需要的DNA用量少的特点,较常规半定量PCR检测的灵敏度高1,000倍,可以直接从甘蔗发病的叶片中检测到病原菌,减少了病原菌的分离、纯化和培养过程,可用于田间对甘蔗梢腐病病原菌小种gx1诊断及检测,节省时间和经费。
1.一种利用分子检测方法检测甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的引物和探针组合FAM-gx1,其特征在于所述引物和探针组合为:引物:FAM-gx1-F1:5’-CCTGATCCGAGGTCAACATTC-3’FAM-gx1-R1:5’-TCGAGCTTCCATAGCGTAGTA-3’Taqman探针:FAM-gx1-P1:5’-CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’;所述Taqman探针的5’端、3’端分别用FAM报导荧光染料和BHQ-1淬灭基团标记。技术领域
本发明涉及一种植物病害的检测方法,具体涉及一种甘蔗梢腐病病原菌(Fusariummoniliforme)小种gx1的分子检测方法,属于生物技术领域。
背景技术
镰刀菌属(Fusarium)最早由link(1809)发现的粉红镰刀菌(F.roseum),并以此为基础而建立的属内分类。镰刀菌属的种类繁多,据DictionaryofFungi记载,至今已报道的镰刀菌超过500种。镰刀菌属是农作物及经济作物的最重要病原真菌之一,是一种最为常见的寄生病原菌,严重影响谷类植物的生长及粮食生产。而且镰刀菌在植物的寄主范围很广,可侵染大多数植物并造成毁灭性的病害,如引起香蕉萎蔫病的尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、水稻恶苗病和甘蔗梢腐病的串珠镰刀菌(F.moniliforme)、小麦赤腐病的禾谷镰刀菌(F.graminearum)、玉米根腐病的梨孢镰刀菌(F.poae)、豆科和瓜类植物根茎腐烂的茄类镰刀菌(F.solani)等。镰刀菌不但会造成作物严重的减产和损失,而且可产生多种次生代谢产物的真菌毒素,如伏马菌素与AAL毒素等具有很强的毒性,能杀死植物细胞核;或富集于粮食的谷粒或种子内,食用后能引发人及家畜肝脏、肾脏的衰竭和癌变(Roche,2010)。甘蔗是重要的糖料作物和理想的能源作物,在甘蔗种植中长期受到真菌性病害的影响,其中镰刀菌是甘蔗真菌性病害中最为严重的病原之一,镰刀菌属所引起的甘蔗梢腐病,主要流行于亚热带和东南亚沿海甘蔗种植区,爆发于高温雨季时期(Viswanathan等,2006)。近年来,该病呈逐渐加重趋势。Hsuan基于形态学和DNA的翻译延伸因子1-α(TEF-1α)基因对甘蔗、玉米和水稻上寄生镰刀菌菌株进行初步鉴别和分类,得到包括F.sacchari,F.moniliforme,F.proliferatum,F.andiyazi,F.verticillioides,G.moniliforme等多个种类的镰刀菌,提出由于寄主的差异,可能对镰刀菌种类要进行新的分类,而不能仅依据形态学鉴定的假说(Shuan等,2010)。目前通过对中国大陆甘蔗各产区的梢腐病调查采样及病原菌的生物地理学研究,对所有采集样品的病原菌分离培养,经形态学鉴定和分子生物学鉴定,以ITS序列聚类分析,初步鉴定中国大陆甘蔗梢腐病病原主要是单一种类镰刀菌F.moniliforme,但有两个小种(gx1和gx2),其中gx1为优势小种。如何对中国甘蔗梢腐病原优势小种gx1进行快速的分类鉴定,不论对植物病理的基础研究还是甘蔗病害防治的应用研究都具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明目的是提供一种甘蔗梢腐病病原菌(Fusariummoniliforme)小种gx1的分子检测方法。所述甘蔗梢腐病病原菌小种gx1,指引起我国甘蔗梢腐病的优势小种,并具有以下特定的核苷酸序列:GACGATTACCAGTAACGAGGGTTTTACTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATCAATTTGGGGAACGCGATTTGACTCGCGAGTCCCAACACCAAGCTGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACA。为了实现上述目的,本发明的技术方案如下:本发明的甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的分子检测方法,首先是依据gx1小种的测序ITS序列,设计用于实时定量PCR的若干引物和Taqman探针组合FAM-gx1以及用于常规半定量PCR的若干引物对Pgx1。一种利用分子检测方法检测甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的引物和探针组合FAM-gx1,其特征在于所述引物和探针组合为下列6个组合中的1个组合;6个引物探针组合如下:FAM-gx1第1组:引物:FAM-gx1-F1:5’-CCTGATCCGAGGTCAACATTC-3’FAM-gx1-R1:5’-TCGAGCTTCCATAGCGTAGTA-3’探针:FAM-gx1-P1:5’-CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’;FAM-gx1第2组:引物:FAM-gx1-F2:5’-TGCTTAAGTTCAGCGGGTATT-3’FAM-gx1-R2:5’-GTCACGTCGAGCTTCCATAG-3’探针:FAM-gx1-P2:5’-CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’;FAM-gx1第3组:引物:FAM-gx1-F3:5’-CGATTACCAGTAACGAGGGTTT-3’FAM-gx1-R3:5’-CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’探针:FAM-gx1-P3:5’-TACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGA-3’;FAM-gx1第4组:引物:FAM-gx1-F4:5’-CTGTTCGAGCGTCATTTCAAC-3’FAM-gx1-R4:5’-GACGATTACCAGTAACGAGGG-3’探针:FAM-gx1-P4:5’-CGCGAGTCCCAACACCAAGC-3’;FAM-gx1第5组:引物:FAM-gx1-F5:5’-CGCAATGTGCGTTCAAAGAT-3’FAM-gx1-R5:5’-ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3’探针:FAM-gx1-P5:5’-TTTGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’;FAM-gx1第6组:引物:FAM-gx1-F6:5’-TGGGCTTGAGGGTTGAAATG-3’FAM-gx1-R6:5’-TCGATGAAGAACGCAGCAAA-3’探针:FAM-gx1-P6:5’-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCC-3’。上述Taqman探针的5’端、3’端分别用FAM报导荧光染料和BHQ-1淬灭基团标记。所述6个引物探针组合中,FAM‐gx1第四组为最佳。使用本发明的引物探针组合检测甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的方法,包括提取甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的DNA、建立qPCR检测的反应体系、qPCR检测的反应程序、定量qPCR检测,其特征在于:(1)提取甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的DNA:采集甘蔗梢腐病样品,经分离纯化培养病原菌的样品提取病原菌DNA;或直接提取病建交界处的叶片DNA。(2)建立qPCR检测的反应体系:qPCR检测的反应体系为1/10体积的10倍PCR反应缓冲液;dNTP各0.1~0.5mmol/L;TaqDNA聚合酶0.1~5国际单位;Taqman探针0.1~0.5mmol/L;分离纯化的DNA模板液0.1~5μl,;一个组合的引物和探针,各0.1~2nmol/L;加无菌去离子水使总体积达到10~100μl;(3)qPCR检测的反应程序:qPCR检测的反应程序为:90-100°C30-60s;90-100°C5-30s,50-70°C20-90s,20~50个循环,在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测,荧光模式设为FAM;(4)qPCR检测结果:qPCR检测结果Ct值为0,表示样品未检出甘蔗梢腐病病原菌小种gx1。为了确保参试菌株为甘蔗梢腐病菌病原菌小种gx1,本发明通过ITS‐PCR方法对所采集的样品进行了病原菌小种gx1鉴定。(1)常规半定量PCR检测鉴定方法:在本发明的常规半定量PCR检测的引物(Pgx1)为下述五个引物组合中的1个组:Pgx1第一组:Pgx1-f1:5’-CGATTACCAGTAACGAGGGTTT-3’Pgx1-r1:5’-GGAGGGATCATTACCGAGTTTAC-3’Pgx1第二组:Pgx1-f2:5’-TGCTTAAGTTCAGCGGGTATT-3’Pgx1-r2:5’-ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3’Pgx1第三组:Pgx1-f3:5’-CTGATCCGAGGTCAACATTCAG-3’Pgx1-r3:5’-ACCTGCGGAGGGATCATTA-3’Pgx1第四组:Pgx1-f4:5’-TTCAGCGGGTATTCCTACCT-3’Pgx1-r4:5’-CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’Pgx1第五组:Pgx1-f5:5’-TATTCCTACCTGATCCGAGGTC-3’Pgx1-r5:5’-TCGATGAAGAACGCAGCAA-3’。在本发明的一个优选实施方案中,所述常规半定量PCR检测的反应体系为:1/10体积的10倍PCR反应缓冲液;dNTP各0.1~0.5mmol/L;TaqDNA聚合酶0.1~5国际单位;分离纯化的DNA模板液0.1~5μl;DNA引物1对,各0.1~2nmol/L;加无菌去离子水使总体积达到10~100μl。在本发明的一个优选实施方案中,所述常规半定量PCR检测的反应程序为:90~98°C1-10min;90~98°C5-60s,58~68°C10-60s,68~74°C30-180s,20-50个循环;68-76°C2-18min,PCR产物用0.5-2.5%琼脂糖电泳检测。本发明的方法以gx1小种的ITS序列易变异区设计特异引物和TanMan探针组合(FAM-gx1)和常规半定量PCR引物对(Pgx1),通过qPCR技术和常规半定量PCR技术可实现对F.moniliforme小种gx1的快速定量检测和小种的准确鉴定。本发明的优点和有益之处在于:本发明的甘蔗梢腐病病原菌小种gx1的分子检测方法,具有灵敏度高,特异性好,所需要的DNA用量少的特点,采用Taqman探针的实时定量PCR检测方法比特异引物的常规半定量PCR检测的灵敏度高1,000倍。实时定量PCR不仅可以检测从叶片中分离的病原菌DNA,而且可以直接从甘蔗发病的叶片中检测到病原菌,减少了病原菌的分离、纯化和培养过程,可用于田间对甘蔗梢腐病病原菌小种gx1诊断及检测,节省时间和经费。附图说明:图1为不同稀释浓度的真菌DNA的qPCR反应扩增曲线,横坐标代表循环数Ct值,纵坐标代表荧光吸收值。图2真菌DNA浓度与Ct值的关系,横坐标(x)代表循环数Ct值,纵坐标(Y)代表DNA浓度。Y_gx1=-0.28x+7.5476(R²=0.9986)图3常规半定量PCR的检测。M为DNA分子量;1表示1000pg/μl;2表示100pg/μl;3表示10pg/μl;4表示1pg/μl;5表示0.1pg/μl;6表示0.01pg/μl;7表示0.001pg/μl;CK为对照0pg/μl。具体实施方式:以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1:供试菌株的分离和培养甘蔗梢腐病病原菌F.moniliforme菌株于2013年甘蔗梢腐病发病盛期在广西、云南、广东和福建等9个市(区)县的甘蔗种植区采集典型发病的甘蔗梢腐病病梢(如表1所示),采用PDA培养基进行分离培养。采取田间发病植株上的典型病斑,进行病原菌的分离培养,具体程序如下:取病健交界处(病斑与健康部分的交界处)的植株组织,剪成边长为0.5cm大小的方块,在70%的酒精溶液中浸泡10秒钟,而后0.1%升汞中灭菌40秒,最后无菌水冲洗三次,置于灭菌滤纸上自然晾干,接于含氨苄青霉素100μg/ml的PDA培养基上,24-30°C倒置培养3-4天。菌丝长出后进行划线纯化培养,倒置培养2-3天后,挑取萌发的单菌落菌丝体再次划线纯化培养,纯化三代。采用无菌水稀释和水琼脂培养相结合的方法分离单孢,用弯曲的无菌玻璃棒将其均匀的涂抹在含有氨苄青霉素100μg/ml的水琼脂培养基上,倒置培养2-3天后,挑取单个孢子在含有含链霉素100μg/ml的查氏液体培养基中,于24-30°C下进行振荡培养,振荡速度为250r/min,该方法用于制备甘蔗梢腐病病原菌的菌丝体。实施例2:病原菌DNA的提取利用离心方法收集实施例1的菌体,即将菌液置于10ml的离心管中,4°C,13,000rpm,离心15min,去上清液后,将沉淀的菌体置于无菌超净工作台吹干。然后,对采用SDS法提取菌丝体的基因组DNA,首先,将离心收集多得到的菌丝体置于研钵,加入液氮并研磨成粉末,转移到1.5mleppendorf管;其次,加入DNA提取液和等体积的酚、氯仿、异戊醇(25:24:1)混合液,剧烈涡旋5min,离心收集上清液。最后,加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),倒换数次充分混匀,4°C,11,000rpm,离心5min,取上清液至新的离心管中。重新抽提一次后(以便除去杂质,提高纯化效率),吸取上清液至新的离心管中,加入两倍体积预冷的无水乙醇(-20°C),-20°C冰箱放置30min左右。取出后12,000rpm,离心12min,于浓缩冷冻离心干燥仪上干燥,然后加入Rnase水溶液,37°C水浴消化1小时,(除去RNA杂质)。琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增判断所提DNA质量后,-20°C保存备用。调整甘蔗梢腐病病原菌gx1小种的代表菌株CNO-1的样品DNA的终浓度为1000μg/ml。实施例3:病原菌的引物和探针的设计通过ITS-PCR方法对上述采集样品所携带的甘蔗梢腐病菌进行鉴定,以ITS真菌通用引物ITS1/ITS4(ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’;ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3")扩增ITS序列。PCR反应所采用的Taq酶购自大连宝生(TaKaRa),引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应总体积分别为25μl内含10×Buffer(含15mmol/LMgCl₂)2.5μl,dNTPs(10mmol/L)0.5μl,Taq酶1U,引物(10μmol/L)各1.0μl,40ng模板DNA。ITS-PCR反应程序为:94°C预变性5min;ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>72°C延伸10min,最后置于4°C保存。PCR结束后,在含有0.1%EB的浓度为1%的琼脂糖凝胶上电泳检测,并送上海生物工程技术服务有限公司测序。利用上述确定的各序列设计实时定量PCR引物和Taqman探针组合(FAM-gx1),其中FAM‐gx1包括下述引物探针组中的一组:FAM-gx1第一组:引物:FAM-gx1-F1:5’-CCTGATCCGAGGTCAACATTC-3’FAM-gx1-R1:5’-TCGAGCTTCCATAGCGTAGTA-3’探针:FAM-gx1-P1:5’-CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’FAM-gx1第二组:引物:FAM-gx1-F2:5’-TGCTTAAGTTCAGCGGGTATT-3’FAM-gx1-R2:5’-GTCACGTCGAGCTTCCATAG-3’探针:FAM-gx1-P2:5’-CATGGCCGCGACGATTACCAGTAA-3’FAM-gx1第三组:引物:FAM-gx1-F3:5’-CGATTACCAGTAACGAGGGTTT-3’FAM-gx1-R3:5’-CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’探针:FAM-gx1-P3:5’-TACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGA-3’FAM-gx1第四组:引物:FAM-gx1-F4:5’-CTGTTCGAGCGTCATTTCAAC-3’FAM-gx1-R4:5’-GACGATTACCAGTAACGAGGG-3’探针:FAM-gx1-P4:5’-CGCGAGTCCCAACACCAAGC-3’FAM-gx1第五组:引物:FAM-gx1-F5:5’-CGCAATGTGCGTTCAAAGAT-3’FAM-gx1-R5:5’-ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3’探针:FAM-gx1-P5:5’-TTTGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’FAM-gx1第六组:引物:FAM-gx1-F6:5’-TGGGCTTGAGGGTTGAAATG-3’FAM-gx1-R6:5’-TCGATGAAGAACGCAGCAAA-3’探针:FAM-gx1-P6:5’-AATCTTTGAACGCACATTGCGCCC-3’利用上述确定的各序列设计常规半定量PCR的引物对(Pgx1),其中Pgx1包括下述引物对中的一组。Pgx1第一组:Pgx1-f1:5’-CGATTACCAGTAACGAGGGTTT-3’Pgx1-r1:5’-GGAGGGATCATTACCGAGTTTAC-3’Pgx1第二组:Pgx1-f2:5’-TGCTTAAGTTCAGCGGGTATT-3’Pgx1-r2:5’-ACAACGGATCTCTTGGTTCTG-3’Pgx1第三组:Pgx1-f3:5’-CTGATCCGAGGTCAACATTCAG-3’Pgx1-r3:5’-ACCTGCGGAGGGATCATTA-3’Pgx1第四组:Pgx1-f4:5’-TTCAGCGGGTATTCCTACCT-3’Pgx1-r4:5’-CCTGTTCGAGCGTCATTTCA-3’Pgx1第五组:Pgx1-f5:5’-TATTCCTACCTGATCCGAGGTC-3’Pgx1-r5:5’-TCGATGAAGAACGCAGCAA-3’。实施例4:Taqman荧光定量PCR检测利用实施例3的引物和Taqman探针组FAM-gx1的第四组进行gx1的荧光定量PCR检测:扩增反应总体积为20μL,其中上下游引物(FAM-gx1-F4/FAM-gx1-R4)500nM,探针(FAM-gx1-P4)250nM,10μlPremixLATaq(TaKaRa,大连),模板1μL,余下用双蒸水补足,置Roche480荧光定量PCR系统运行分析,在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测,荧光模式设为FAM。反应程序为:95°C30s;95°C5s,60°C30s,40个循环。表1.依据F.moniliforme的序列设计的特异引物对于19个田间样品进行Taqman实时定量PCR和常规半定量PCR检测ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="565"/>表1的结果表明,感gx1小种的样品可以检测到Ct值在16~23,但是没有感染gx1的样品的Ct值为0,说明Taqman探针FAM-gx1结合qPCR的方法,具有较好的特异性,可用于甘蔗梢腐病病原菌的小种检测和鉴定。实施例5:常规半定量PCR检测技术利用实施例3的引物对Pgx1进行gx1小种的常规半定量PCR检测鉴定:反应体系为25μl,分别以鉴定特异引物Pgx1-f1/Pgx1-r1扩增反应,PCR体系为:TaqDNA聚合酶(ThermoFisher,加利福尼亚)0.15μl,2.5μlTaqbuffer,1μlMgcl₂,引物1μl(10μM),0.4μldNTPs模板为1μl,最后用18μl双蒸水定容至25μl。PCR反应置于eppendrofAGPCR系统运行。反应条件:94°C4min;94°C15s,63°C15s,72°C30s,30个循环;72°C10min。PCR产物用2%琼脂糖电泳检测。表1结果表明,用Pgx1鉴定的结果与实时定量PCR的鉴定结果相同,感染gx1的样品检测结果均为阳性。本领域技术人员可以预知,上述引物组替换为实施例3的其他引物组也可以取得相同的技术效果。且上述反应体系还可以为:1/10体积的10倍PCR反应缓冲液;dNTP各0.1~0.5mmol/L;TaqDNA聚合酶0.1~5国际单位;分离纯化的DNA模板液0.1~5μl,;DNA引物1对,各0.1~2nmol/L;加无菌去离子水使总体积达到10~100μl。反应程序还可以为:90~98°C1-10min;90~98°C5-60s,58~68°C10-60s,68~74°C30-180s,20-50个循环;68-76°C2-18min,PCR产物用0.5-2.5%琼脂糖电泳检测。实施例6:实时定量PCR和常规半定量PCR检测的敏感性分析(1)Taqman探针qPCR的敏感性分析:调整甘蔗梢腐病原菌(F.moniliformegx1)的典型菌株CNO-1样品DNA的终浓度为1,000μg/ml。进行10倍系列系稀释,分别用特异鉴定Taqman探针FAM-gx1进行qPCR检测,得到如图1所示的动力学曲线。(2)特异鉴定引物的常规半定量PCR敏感性分析:用特异鉴定引物Pgx1对上述CNO-1的相同10倍系列稀释DNA样品进行常规半定量PCRCR扩增反应和电泳检测鉴定。结论:探针FAM-gx1对CNO-1的DNA样品在6个稀释度(10-1~10-6)的范围内定量PCR呈S型扩增曲线(图1);且不同稀释度之间的Ct值相差均匀,符合定量PCR的Ct值与起始拷贝数之间严格的线性关系(图2),因此,样本拷贝数与Ct值之间有良好的相关性。由于真菌DNA模板的浓度比较高,可能会对特异探针的扩增产生干扰和影响,为了保证鉴定结果的可靠性和准确性,结合多次重复实验分析,确定Taqman探针FAM-gx1鉴定F.moniliforme的gx1小种检测极限Ct值为32,即真菌的检测DNA的极限浓度为10pg/μl。用特异鉴定引物Pgx1对CNO-1的10倍系列稀释DNA样品进行常规半定量PCR检测,在10⁰至10^-2之间,扩增条带单一,亮度呈减弱趋势,在稀释的DNA样品至10^-3无可见明显的条带,呈阴性(图3)。说明特异鉴定引物Pgx1检测真菌DNA极限浓度为10ng/ul。综上所述,Taqman探针的实时定量PCR检测方法的灵敏度要比特异引物的常规半定量PCR鉴定高1,000倍。